生物芯片的技术核心(2)

3、芯片点样技术

点样法是将预先通过液相化学大量合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器（arraying and replicating device，ARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上（支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷），再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。

点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。点样机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。

现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以，“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列（例如2500点/cm2），“喷印”法由于“喷印”的斑点较大，所以只能形成较低密度的探针阵列，通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取，适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵，用于科研和实践工作。目前，除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外，大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。

4、探针的制备技术

探针（探针的功能是识别靶序列和携带报告分子（如同位素、荧光、地高辛等））：为了提高监测灵敏度，人们的努力放在信号放大以及模板扩增两个方面，其中应用经过特殊处理的探针方法可以提高灵敏度的方法有三种：分支探针这种方法的原理是，设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针，分支末端以酶标记。这样，经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。）、分子信标（Molecular beacon, MB，一种设计巧妙的荧光标记的核酸探针，未杂交状态下为发夹结构，在发夹的两端分别连接荧光素分子和猝灭分子，利用荧光共振能量转移原理（FRET））、肽核酸（Peptide nucleic acids, PNA，以中性酰胺键为骨架，不带电荷，为DNA类似物。与DNA的亲和性高、酶解稳定性好，因此多用来做诊断和检测用探针）探针3项技术。

5、杂交反应及过程控制技术

芯片杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步。杂交时选择的条件要使成千上万对的杂交反应中的最大多数处于最佳状态中，也就是说要使得尽可能多的正确配对物都不遗漏（假阴性尽可能少），有错配的杂交降低至最低（假阳性尽量少），这是非常难以达到的境界。

目前杂交是提高芯片在实际应用中的准确性的关键步骤之一。杂交条件的构建要根据芯片的实际情况进行最优化。

杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括：（1）寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。（2）支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。有研究表明，选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍。（3）杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些；而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。研究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好。（4）GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。（5）探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。（6）核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度。(责任编辑：admin)